Referências bibliográficas

• [1] processo. Segundo Mitchell et al(2006) o primeiro passo a ser dado no desenvolvimento de um processo de FES é a avaliação do mesmo em pequena escala, tal como frascos Erlenmeyer ou colunas de fermentação. Nesse procedimento, as principais variáveis são alteradas segundo um planejamento experimental para se averiguar a influência de cada uma na formação dos produtos desejados. No Laboratório de Agroenergia da Embrapa Instrumentação – São Carlos – SP, foi desenvolvido de um biorreator do tipo colunas dotado de instrumentação e automação da umidade relativa do ar e da temperatura do ambiente. A principal característica desse instrumento é o controle preciso da umidade relativa do ar que alimenta o biorreator, passando de maneira forçada através do substrato, para uma faixa de temperaturas e fluxo de ar, respectivamente variando de 20°C a 46°C e de 0,5vvm a 2vvm. Com esse sistema, algumas caracterizações dos processos de FES foram realizadas a fim de se avaliar a produção das enzimas celulolíticas em diferentes condições da aeração, umidade relativa, fluxo do ar e umidade inicial do substrato (UIS)(Farinas et al., 2011),(Vitcosque et al., 2012)e(Pirota et al., 2013). Os resultados apresentados nesses trabalhos apontam que para a maior parte dos fungos estudados a aeração ótima é cerca de 1 vvm (20_x0001D45A__x0001D43F_/_x0001D45A__x0001D456__x0001D45B_) e umidade relativa do ar a 80%. A produção das celulases ainda depende da temperatura do meio fermentativo, pois o crescimento microbiano varia com a temperatura do processo. Nesse trabalho foi realizado um estudo da cinética de produção das enzimas CMCase e xilanase, avaliando-se a produção das mesmas de 24 em 24 horas durante as primeiras 72 horas do processo em diversas condições ambientais. Para tal, foi realizado um planejamento composto central (CCD) com 11 ensaios independentes, variando-se a temperatura do processo e a UIS, o queresultou em superfície de resposta da cinética das enzimas nas condições avaliadas.O objetivo primário dessa avaliação é a realização de uma modelagem matemática do processo a fim de se otimizá-lo quanto às condições iniciais e as condições ao longo do processo. No entanto, as superfícies de resposta apresentam resultados interessantes do ponto de vista de controle do processo. Por isso, o principal objetivo desse artigo foi avaliar quais as condições mais favoráveis na produção das enzimas estudadas e qual o Área temática: Processos Biotecnológicos 2melhor momento para se interromper o processo a fim de se obter a maior concentração das mesmas. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2. Biorreator Instrumentado O biorreator de escala laboratorial utilizado consiste em 16 colunas (2,5 cm de diâmetro, 20 cm de comprimento), climatizadas em banho térmico. O mesmo foi equipado com um sistema online de controle do fluxo e da umidade relativa do ar que alimenta as colunas. O algoritmo foi desenvolvido no Laboratório de Agroenergia e implementado pela interface LabView® 8.2., NationalInstruments, USA. Para esse trabalho, fixou-se em todos os cultivos, vazão de 20 mL/min (1vvm) e umidade relativa do ar de 80%.As medidas da temperatura e da umidade relativa do ar foram feitas com uma sonda HMT330, Vaisala, Finland com precisão de 0,4°C e 1,5%, respectivamente.O controle da umidade relativa foi feito ajustando-seautomaticamenteaproporção entre ofluxo de ar saturado o fluxo total a fim de compensar o sinal da realimentação do sensor de umidade. Nessa etapa foi utilizado um controlador do tipo Proporcional Integral. As linhas de entrada de ar foram controladas pelo modelo GFM 17, Aalborg, USA no qual o sinal de referência varia de 0 a 5 V e o fluxo de ar varia de 0 a 686 mL/min, com erro de medida de 1,5%. Um sensor foi utilizado para medir a pressão relativa da linha de alimentação de ar, modelo 26PC de 0 a 1 atm daHoneywell, USA. Todas as medidas realizadas foram gravadas em um computador através de um equipamento de aquisição de dados NI USB-6229, NationalInstruments, USA de 16 entradas referenciadas (ou 8 diferenciais) e 4 saídas analógicas para fins de comando externo, com período de amostragem de um minuto.Esse reatortambém possui um sistema de monitoramento do CO2 produzido durante o cultivo, realizado pelo sensor GMM221, Vaisala, com sensibilidade de 0 a 5%. 2.2. Fermentação em Estado Sólido (FES) para Produção de Enzimas O fungo utilizado foi oAspergillus niger (3T5B8), mutante da coleção da EmbrapaTecnologia de Alimentos. Este mutante foi obtido por técnicas convencionais de mutação induzida usando agentes químicos e físicos por (Couri e Defarias, 1995). A cultura foi mantida em tubos em meio PDA a temperatura ambiente, sob fina camada de óleo mineral. Conduziu-se a FES nas colunas do biorreator instrumentado citado anteriormente, contendo aproximadamente 10 g de farelo de trigo. Após a inoculação dos esporos (107 esporos/g) foi adicionado uma quantidade sempre fixa de solução nutriente de Sulfato de Amônio 0,91% em HCl 0,1 M com diferentes volumes de água para obtenção de UISconforme o planejamento experimental proposto em base úmida. 2.3. Extração do Meio Enzimático Após o período de cultivo, foram adicionados ao material fermentado tampão acetato de sódio 0,1 M, pH 4,8 na relação de 1:10 (m/v), sendo homogeneizado e posteriormente agitado por 30 min, a 200 rpm. O material foi, posteriormente, filtrado e centrifugado a 10000 rpm durante 20 min, a 4ºC, e o sobrenadante utilizado como solução enzimática bruta. Área temática: Processos Biotecnológicos 32.4. Atividades Enzimáticas e Métodos Analíticos A atividade da xilanase foi medida em mistura de reação contendo 1mL de extrato enzimáticoe 2 mL de solução de xilana 1% em tampão acetato 0,2 M e pH 5,0.Após incubação a 50 C por 30 minutos, os açúcares redutores foram quantificados pelo método DNS (Miller, 1959).Procedimento semelhante foi utilizado para a atividade de CMCase, onde o substrato utilizado foi 1 mL de solução 4% de CMC em tampão citrato de sódio 50mM e pH 4,8 com o tempo de incubação de 10 minutos. 2.5. Planejamento Experimental O planejamentodesse trabalhoconsiste no uso da metodologia da superfície de resposta a partir do delineamento composto central (CCD) com 11 ensaios independentes conforme a Tabela Até o presente momento, o ensaio 11 não foi realizado e no ensaio 10 estão faltando os valores das amostras de 72 horas. Tabela 1 - Ensaios do planejamento. Ensaio Umidade Substrato -1,41 -1 0 +1 +1,41 36% 40% 51% 62% 66% Temperatura +1,41 46°C