Referências bibliográficas

• [1] gerado após o milho ser debulhado, e que geralmente é usado para ração animal, têm se mostrado atrativo para a produção de etanol chamado de segunda geração (AGUIAR, 2010). O grande desafio apresentado pelo uso da biomassa lignocelulósica está em conseguir desmontar a sua resistente estrutura (ROGALINSKI, et. al., 2008). A celulose, que é o polímero de interesse, encontra-se na envolvida pela hemicelulose e lignina, dificultando seu acesso, fazendo com que seja necessária a realização de um pré-tratamento. O objetivo principal dessa etapa é romper a estrutura cristalina da celulose, fazendo com que os açúcares disponíveis se tornem passíveis à fermentação (SANTOS et. al., 2013). Área temática: Engenharia Ambiental e Tecnologias Limpas 1Diversos tipos de pré-tratamentos têm sido avaliados na literatura, com o intuito de otimizar o aproveitamento dos lignocelulósicos, visto que a etapa de pré-tratamento apresenta grande impacto na digestibilidade da celulose e também na toxicidade da fermentação (GALBE, ZACCHI, 2007). Nessa categoria, estão incluídos os pré-tratamentos físicos, químicos, biológicos ou uma combinação desses (SUN; CHENG, 2002). O pré-tratamento com ácido diluído encontra-se na categoria dos pré-tratamentos químicos e consiste em submeter o material à uma solução ácida de aproximadamente 4% (p/p) e, em seguida, aquecimento até temperaturas entre 140 e 200 °C por períodos de alguns minutos até aproximadamente uma hora. A hidrólise da fração hemicelulósica é uma das reações que ocorrem durante os pré-tratamentos com ácidos, especialmente das xilanas e das glucanas. A depender das condições de pré-tratamento utilizadas, pode haver formação de produtos de degradação, como é o caso do furfural, pela degradação de pentoses e do hidroximetilfurfural, pela degradação das hexoses. Esses componentes podem influenciar negativamente a etapa da fermentação, devendo, portanto serem evitados ou até mesmo removidos (PALMQVIST; HAHN-HAGERDAL, 2000). O objetivo do presente trabalho foi apresentar um estudo do pré-tratamento ácido do sabugo de milho, através da realização de um planejamento fatorial em estrela com três fatores, tempo, temperatura e concentração de H2SO4, em que o teor de açúcares redutores totais e acidez foram as respostas obtidas. A escolha dos níveis dos fatores foi devido a limitações dos equipamentos ou baseados em estudo já realizados na literatura. Após a etapa do pré-tratamento, etapas de hidrólise, com a enzima Acellerase 1500, e a fermentação etanólica com fermento comercial foram realizadas. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2. Materiais O sabugo de milho in natura foi oriundo de espigas de milhos compradas na feira livre da cidade de Maceió-AL. O extrato enzimático (Accelerase 1500) foi gentilmente cedido pela UFSCar, através de projeto de cooperação. Na etapa de fermentação foi utilizada a levedura Saccharomyces cerevisiae (comercial na forma liofilizada da marca Fermix). Os demais reagentes de laboratório foram adquiridos em grau analítico e não sofreram qualquer tratamento antes de sua utilização. 2.2. Métodos Secagem e trituração dos sabugos Os sabugos foram cortados em tamanhos menores e em seguida, passaram por secagem em estufa (à 45°C). Após se apresentar desidratado, o que levou em torno de 7 dias, foi triturado em um liquidificador industrial. Determinação do teor de umidade A umidade da biomassa foi medida empregando-se um determinador de umidade modelo ID50 (Marte Balanças e Aparelhos de Precisão Ltda) a 100°C em modo automático. Área temática: Engenharia Ambiental e Tecnologias Limpas 2Pré-tratamento com ácido sulfúrico Um planejamento experimental com três fatores, em estrela e triplicata no ponto central foi realizado, com o objetivo de otimizar o pré-tratamento. Os três fatores estudados foram: tempo, temperatura e concentração de H2SO4. Os pontos em estrela estão a uma distância de √2 unidades codificadas do ponto central. As respostas avaliadas foram acidez e açúcares redutores totais (ART), onde duas melhores condições, em termos de ART obtido, foram escolhidas para seguir às etapas de hidrólise enzimática e fermentação. A metodologia do pré-tratamento ácido é descrita a seguir. A massa seca de material foi pesada em balança analítica de acordo com o teor de umidade; A razão foi de 1:10 (massa de material seco/volume de solução ácida), como proposto por SILVA et al. (2010). A massa foi medida para um volume final de 100 mL; As soluções de ácido sulfúrico foram preparadas de acordo com a concentração requerida; A massa do material foi adicionada ao Erlenmeyer e em seguida o volume da solução de ácido; Os Erlenmeyers foram tampados e colocados na autoclave; Após o tempo de experimento, as amostras foram retiradas da autoclave e filtradas; O teor de ART e a acidez foram determinados do licor obtido desse pré-tratamento. Determinação dos açúcares redutores totais (ART) e acidez A determinação dos açúcares redutores totais (ART) foi feita pelo método espectrofotométrico, proposto por Miller (1959), que utiliza a solução de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) e leitura a 540 nm. A acidez foi determinada conforme metodologia do Instituto Adolf Lutz (1985). Hidrólise enzimática Os experimentos submetidos à hidrólise enzimática foram realizados utilizando a enzima comercial Accellerase 1500. Os ensaios ocorreram segundo Silva (2011), com 1,0% de carga de sólidos. A solução para hidrólise continha 60 mL de tampão citrato, pH 4,8 (50 mM), 38 mL de água destilada e 2 mL da enzima. A hidrólise enzimática ocorreu em frascos Erlenmeyer de 250 mL em Shaker, à 50°C e 150 rpm, por 72 horas. Após a hidrólise enzimática, o ART foi determinado. Fermentação do hidrolisado enzimático O microrganismo utilizado para a fermentação etanólica foi a levedura Saccharomyces cerevisiae comercial. Os ensaios ocorreram de acordo com Wolf (2011), onde o líquido contendo glicose resultante da hidrólise enzimática foi utilizado na fermentação. Para o preparo do inoculo, foi utilizado o meio de cultura YPD. Em frascos Erlenmeyer de 250 mL foram adicionados: 30 mL do hidrolisado, 0,6 g de peptona bacteriológica e 0,3 g de extrato de levedura. O meio foi esterilizado à 121°C por 15 min. Após isso, foi adicionada 6,7 mL da solução de sulfato de magnésio e fosfato de amônio e por último, 0,3 g do fermento. A fermentação ocorreu em Shaker à 30°C, 200 rpm por 24 horas. O teor alcoólico foi determinado por destilação, utilizando-se o método espectrofotométrico a partir do dicromato de potássio. O rendimento da fermentação (Rf) foi calculado pela relação entre a quantidade de etanol produzido (g/L) e de ART presente inicialmente (g/L). Já a eficiência da fermentação (Ef) foi determinada pela relação entre o rendimento real da fermentação (Rf) e o teórico de 0,51 (NOGUEIRA; VENTURINI-FILHO, 2005). Área temática: Engenharia Ambiental e Tecnologias Limpas 33. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3. Matriz de Planejamento do Pré-tratamento Ácido A Tabela 1 apresenta a matriz de planejamento do sabugo de milho, com todas as condições do pré-tratamento ácido, de acordo com o planejamento em estrela com triplicata no ponto central e as respostas obtidas. O teor de ART da biomassa in natura foi de: 17,88%. Tabela 1 - Matriz de planejamento: Resultados para o sabugo de milho Ensaio Fator 1 (tempo) Fator 2 (temperatura) Fator 3 (concentração H2SO4) ART (%) Acidez (%) 1 15 (-) 100 (-) 0,5 (-) 24,1 0,5 2 120 (+) 100 (-) 0,5 (-) 40,6 0,6 3 15 (-) 120 (+) 0,5 (-) 42,6 0,5 4 120 (+) 120 (+) 0,5 (-) 38,9 0,6 5 15(-) 100 (-) 3,5 (+) 36,4 2,6 6 120 (+) 100 (-) 3,5 (+) 23,3 1,8 7 15 (-) 120 (+) 3,5 (+) 26,5 3,0 8 120 (+) 120 (+) 3,5 (+) 24,5 1,6 9 67,5 (0) 110 (0) 2 (0) 24,3±0,7 0,8±0,1 10 67,5 (0) 110 (0) 2 (0) 26,5±0,7 0,7±0,1 11 67,5 (0) 110 (0) 2 (0) 24,9±0,7 0,6±0,1 12 7 (-√2) 110 (0) 2 (0) 61,5 1,6 13 142 (+√2) 110 (0) 2 (0) 15,3 1,2 14 67,5 (0) 96 (-√2) 2 (0) 17,5 1,1 15 67,5 (0) 124 (+√2) 2 (0) 5,6 1,2 16 67,5 (0) 110 (0) 0,1 (-√2) 11,5 0,2 17 67,5 (0) 110 (0) 4 (+√2) 32,2 3,8 Pela Tabela 1, verifica-se que as duas condições de maiores percentuais de ART foram a 3, com 42,6% de ART e 0,5% de acidez e a 12, com 61,5% de acidez e 1,6% de acidez, seguindo portanto para as etapas de hidrólise e fermentação. 3.2. Análise de Variância – Modelo Estatístico Área temática: Engenharia Ambiental e Tecnologias Limpas 4Para verificar se o modelo estatístico obtido é adequado ao sistema que se quer descrever, é necessário adequá-lo a um modelo empírico que possa reproduzir com confiança os dados experimentais. Para isso, constrói-se a tabela ANOVA – análise de variância. Nesse trabalho, o ajuste mais adequado aos dados se deu por um modelo cúbico (BRUNS, et. al., 2001). As Tabelas 2 a 3 apresentam os resultados da ANOVA para cada resposta obtida no planejamento experimental. Observa-se que para ambos os casos, o modelo cúbico se adequou satisfatoriamente, visto que o percentual de variação explicada esteve sempre bem próximo ao percentual de variação explicável pelo modelo. As superfícies de resposta dos modelos cúbicos também são apresentadas nas Figuras 1 e 2, considerando o nível inferior do tempo. Tabela 2 - ANOVA para o modelo cúbico: ART sabugo Fonte de Variação Soma quadrática Nº de graus de liberdade Média quadrática Regressão 2822,60 13 217,12 Resíduo 2,59 3 0,86 Falta de Ajuste 0,08 1 0,08 Erro Puro 2,51 2 1,26 Total 2825,19 16 % de variação explicada: 99,908 % de variação explicável: 99,911 Figura 1 - Superfícies de resposta em 3 dimensões para o ART do sabugo no nível inferior de tempo. Pela Figura 1, é possível perceber que também obtem-se maiores teores de ART em condições de baixa concentração de ácido e elevadas temperaturas, dada pela região em vermelho intenso. Com a análise estatística dos fatores nota-se que quando a concentração de ácido sai do nível inferior para o nível superior há uma redução, em média, de 4,4% do teor de ART. Logo, para Área temática: Engenharia Ambiental e Tecnologias Limpas 5trabalhar com maiores valores de ART (%) deve-se utilizar concentrações de H2SO4 em torno de 0,5%, nível inferior. O efeito da concentração de ácido com a temperatura e/ou com o tempo, apresentou que haverá redução no ART ao sair de seus níveis inferiores para superiores. Redução de 3,48% para o caso da interação da concentração de ácido com o tempo e de 3,20% para o efeito da concentração de ácido com a temperatura. Esse é mais um indicativo de que deve-se trabalhar no nível inferior de concentração de ácido. Em relação à temperatura, nota-se que há aumento de 1,02% no teor de ART quando se utiliza o nível superior. O tempo foi o que se mostrou menos significativo, porém a análise mostra indicativos de que deve-se trabalhar com 15 minutos, nível inferior, para se obter maiores teores de ART. Tabela 3 - ANOVA para o modelo cúbico: Acidez sabugo Fonte de Variação Soma quadrática Nº de graus de liberdade Média quadrática Regressão 15,63 13 1,20 Resíduo 0,39 3 0,13 Falta de Ajuste 0,36 1 0,36 Erro Puro 0,03 2 0,01 Total 16,01877 16 % de variação explicada: 97,59 % de variação explicável: 99,82 Figura 2 - Superfícies de resposta em 3 dimensões para a Acidez do sabugo no nível inferior de tempo. Pela Figura 2, nota-se que baixos níveis de acidez são dados em baixas concentrações de ácido sulfúrico a qualquer temperatura. A região em azul intenso indica onde se tem mais baixa acidez. Área temática: Engenharia Ambiental e Tecnologias Limpas 6A análise estatística fornece que, na faixa investigada, a temperatura não mostrou ser um fator significativo na resposta da acidez, nem mesmo a interação da mesma com os outros fatores. A concentração de ácido foi o mais significativo dos três fatores nas condições estudadas. Em relação às interações, a da concentração do ácido com o tempo foi a que se mostrou mais significativa, e o efeito de interação mostra que o menor tempo aliado as menores concentrações de ácido fornecem os menores percentuais de acidez. Em relação à análise conjunta das duas respostas estudadas, para maiores valores de ART e menores de Acidez, que é o desejado, deve-se utilizar temperatura em seu nível superior, 120°C, tempo de 15 minutos e concentração de H2SO4 em torno de 0,5%, ambos nos níveis inferiores. 3.3. Etapas de Hidrólise Enzimática e Fermentação A Tabela 4 apresenta os resultados após as etapas de hidrólise enzimática e fermentação. As análises foram em relação ao ART presente nas amostras. Tabela 4 – Resultados obtidos após as etapas de hidrólise enzimática e fermentação Condição do Planejamento Concentração de ART no hidrolisado (g/L) Conversão Enzimática (%) Etanol Produzido (g/L) Rendimento da Fermentação (%) Eficiência da Fermentação (%) 3 (15 min; 120°C; 0,5% de H2SO4) 6,1 34,3 2,2 36,1 70,8 12 (7 min; 110°C; 2% de H2SO4) 8,7 51,4 2,5 28,7 56,3 Pode-se perceber que a maior eficiência fermentativa se deu na condição 3 do pré-tratamento ácido (15 min; 120°C e 0,5% H2SO4): 70,8%. Nessa condição, o teor de acidez foi o menor, viabilizando maior produção de etanol. 4. CONCLUSÕES Por meio do planejamento experimental foi possível se obter um modelo cúbico significativo para explicar as variáveis estudadas sobre a liberação de açúcares fermentescíveis do sabugo de milho pré-tratado com ácido. Os maiores índices de ART e baixos teores de acidez foram dados ao se utilizar altas temperaturas e baixas concentrações de ácido, na faixa investigada. Também na faixa estudada, o fator tempo não se apresentou como significativo. O sabugo apresentou melhores rendimentos em ART nas condições de: 15 min, 120 °C e 0,5% de H2SO4. A acidez, nessa condição apresentou valores baixos; outra condição de bons resultados foi com 7 min, 110 °C e 2% de H2SO4.

• [2] Contudo nesse caso o teor de acidez foi mais acentuado. Nas etapas de hidrólise e fermentação, obteve-se melhores resultados com a condição 3 do pré-tratamento com eficiência de fermentação de 70,8%. Área temática: Engenharia Ambiental e Tecnologias Limpas 75. AGRADECIMENTOS A CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior - e ao CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - pelo apoio financeiro. 6. REFERÊNCIAS AGUIAR, C. M. Hidrólise enzimática de resíduos lignocelulósicos utilizando celulases produzidas pelo fungo Aspergillus niger. PPG-EQ/Unioeste. Dissertação de Mestrado, 2010; BRUNS, R. E.; NETO, B. B.; SCARMÍNIO, I. S. Como fazer experimentos. Pesquisa e desenvolvimento na ciência e na indústria, 2ª edição, Editora Unicamp, 2001; DAGNINO, E .P.; CHAMORRO, E. R.; ROMANO, S. D.; FELISSIA, F. E.; AREA, M. C. Optimization of the acid pretreatment of rice hulls to obtain fermentable sugars for bioethanol production. Industrial Crops and Products, Elsevier. p.363-368, 2012; GALBE, M.; ZACCHI, G.; Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production. 2007, 108, 41; INSTITUTO ADOLF LUTZ (IAL). Métodos Químicos para Análise de Alimentos. 3 ed. São Paulo, 1985; MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, v.31, p. 426-428, 1959; NOGUEIRA, A. M. P.; VENTURINI-FILHO, W. G. Aguardente de cana. Botucatu: UNESP/Faculdade de Ciências Agronômicas, 2005. Disponível em: Andlt;http://dgta.fca.unesp.br/docentes/waldemar/aguardente/Aguardente.pdfAndgt;. Acesso em: 27 de janeiro de 2014; PALMQVIST, E.; HAHN-HAGERDAL, B. Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. I: inhibition and detoxification. Bioresource Technology, v. 74, n. 1, p. 17-24, 2000; ROGALINSKI, T.; INGRAM, T.; BRUNNER, G. Hydrolysis of lignocellulosic biomass in water under elevated temperatures and pressures. J. of Supercritical Fluids, 47 (2008) 54–63, 2008; SANTOS, F.; QUEIROZ, J. H.; COLODETTE, J.; SOUZA, C. J.; Cana-de-Açúcar Andamp; Espécies Florestais. Bioenergia Andamp; Biorrefinaria; eds.; Ed. da UFV: Viçosa, 2013, cap. 4; SILVA, G. M. Pré-tratamento do bagaço de cana de açúcar com amônia aquosa para a produção de etanol. Dissertação de mestrado, UFSCar, São Carlos – São Paulo, 2011; SUN, Y.; CHENG, J. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresour. Technol., 83:1–11, 2002; WOLF, L. D. Pré-tratamento organossolve do bagaço de cana-deaçúcar para a produção de etanol e obtenção de xilooligômeros. 148 p. Dissertação de mestrado – Departamento de Engenharia Química, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, 2011.