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A necessidade de diversificação da matriz energética mundial vem intensificando as pesquisas relacionadas às energias renováveis, como aquelas provenientes de resíduos agroindustriais. Assim, esse estudo objetivou avaliar a etapa de pré-tratamento da biomassa lignocelulósica, visando a obtenção de açúcares. Para tanto, realizou-se um Planejamento Fatorial Completo para avaliar as variáveis ?concentração de glicerina? e ?tipo de agente químico? na etapa de pré-tratamento, tendo como variável resposta a concentração de açúcares fermentescíveis. A hidrólise enzimática da biomassa tratada foi realizada utilizando-se os complexos enzimáticos Ctec2 e Htec2, nas porcentagens de 2 e 0,5% (v/m), respectivamente. A glicerina apresentou um efeito negativo no processo, enquanto a adição dos agentes químicos hidróxido de cálcio e óxido de cálcio apresentaram resultados positivos na quebra da rigidez estrutural da biomassa, obtendo-se um mosto com concentrações próximas a 0,31 gaçúcares/gbiomassa após hidrólise enzimática, o que corresponde a aproximadamente 47,4% de rendimento em relação a quantidade de celulose e hemicelulose presentes na biomassa. Diante disso, demonstrou-se que a biomassa residual do milho é uma matéria-prima promissora para produção de bioetanol. No que se refere à utilização de agitação mecânica, empregando impelidor do tipo hélice naval, foi possível afirmar que, trabalhando-se com razão sólido/líquido de 60 g/L, o mesmo manteve o meio homogêneo, sendo favorável à produção de bioetanol lignocelulósico em reator tipo batelada.