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Na busca por fontes alternativas de energia, a biomassa vem se destacando devido à sua abundância e versatilidade energética. Além da geração de energia através da queima, a biomassa lignocelulósica, composta principalmente por celulose, hemicelulose e lignina, também pode ser utilizada na produção de biocombustíveis e diversos produtos de interesse econômico, como por exemplo, produtos da lignina. Objetivando a separação dos componentes da biomassa para geração de produtos de valor agregado, realizou-se nesse trabalho o pré-tratamento organossolve da biomassa residual de eucalipto, utilizando como solvente a glicerina bruta, subproduto na produção do biodiesel. Foram definidas como variáveis para análise do processo, a temperatura, o tempo de reação e a concentração de glicerina bruta em água,. Após o pré-tratamento, obteve-se uma biomassa deslignificada (fase sólida), e uma fase liquida (licor negro) contendo a lignina extraída. Com uma etapa posterior de decantação ácida do licor negro, a lignina foi separada e quantificada. A partir de análise estatística, encontrou-se que os pré-tratamentos realizados em maior temperatura (220°C) e concentração (80%), apresentaram melhores extrações de lignina, obtendo como valor ótimo 11,25g de lignina/100g de biomassa. O uso de resíduos no pré-tratamento e a obtenção da lignina podem viabilizar a realização do processo, pois geram redução de custos e produtos de interesse comercial.